Peptide afbeelding om eiwitstructuren te identificeren

March 8, 2022

Deze methode identificeert de integriteit en de nauwkeurigheid van de primaire structuur van de proteïne door aangewezen analysemethoden na splijten van de proteïne door proteasen of chemische producten.

 

De eerste methode: trypsinelysis - reversed-phase hoge prestaties vloeibare chromatografie

 

Bepaald door hoge prestaties vloeibare chromatografie.

 

Chromatografische voorwaarden: kiezelzuurgel octylsilane-in entrepot of kiezelzuurgel octadecylsilane-in entrepot als vuller voor proteïne en peptide analyse: 0,1% trifluoroacetic zuur in mobiele fase als mobiele fase A in 0,1% trifluoroacetic zuur in acetonitrile de oplossing was mobiele fase B, was het stroomtarief 1 ml per minuut, en de gradiënt werd uitgewassen 70 minuten (van 100% aan 30% voor oplossing A en van 0 aan 70% voor oplossing B).

 

Kolomtemperatuur: 30 °C ± 5 °C,

 

Behoud en de opslagtemperatuur van de teststeekproef: 2~ 8 °C,

 

Opsporingsgolflengte: 214nm,

 

Inspectiemethode: neem de testoplossing en de verwijzingsoplossing die (al 1mg-oplossing per lml, als de concentratie van de teststeekproef en de verwijzing niet genoeg is, zou het aan de overeenkomstige concentratie moeten worden geconcentreerd), respectievelijk, 1%-de oplossings Volledige dialyse gebruiken van het ammoniumbicarbonaat, voegt 1:50 (mg/mg) aan de trypsineoplossing toe [trypsine van toluenesulfonylalanylchlorone keton voegt de behandelde (of zuivere opeenvolgingsanalyse), 1%-de oplossing van het ammoniumbicarbonaat toe om aan een oplossing op te lossen die 0,1 mg per 1 ml bevatten] aan de testoplossing te nemen en de verwijzingsoplossing, na incubatie bij 37 °C 16 tot 24 uren, voegt een het azijnzuuroplossing van 50% bij 1:10 toe, en centrifugeer bij 10.000 t/min 5 minuten. (Of gefiltreerd door een 0,45 filter μm), neem nauwkeurig 100 μl van de bovendrijvende substantie, spuit in de vloeibare chromatograaf in, was in een gradiënt uit, en registreer het chromatogram. De kaart van de testoplossing wordt vergeleken met de kaart van de verwijzingsoplossing.

 

De tweede methode: cyanogen bromidelysis

 

Inspectiemethode: Neem het passende bedrag van teststeekproef en referentiestof (ongeveer 50μg van proteïne), dialyseer met water 16 uren, vriesdroog, toevoegen cyanogen bromide lysate [weeg cyanogen bromide 0.3g, toevoegen het mierezuur (70% - 100%) 1 ml in 20 μl werd opgelost, verlaten bij kamertemperatuur 24 uren, en lysate met water (180 μl) werd toegevoegd, gevolgd door lyofilisatie. Gevriesdroogd wordt lysate opnieuw samengesteld met water aan de aangewezen concentratie. De elektroforese werd uitgevoerd door SDS de elektroforese van het polyacrylamidegel (20%-gelatinering) en werd bevlekt door zilveren te bevlekken. Vergelijk de teststeekproef met de verwijzingskaart.